黄芪甲苷黄芪多糖
张秋海+丁家欣+李树莉+刘泓+彭春龙
摘要：目的 通过不同生长年限黄芪药材中黄芪甲苷和黄芪多糖的含量比较，为选择黄芪的适宜采收时间提供依据。方法 采用高效液相色谱蒸发光散射检测法测定黄芪甲苷含量，色谱柱为Hypersil-Keystone C18，流动相为乙腈-水（33∶67），流速1 mL/min，漂移管温度105 ℃，空气流速2.7 L/min。采用苯酚-硫酸比色法测定黄芪多糖含量，测定波长490 nm。结果 黄芪甲苷的线性范围为1.25～6.28 ?g，平均回收率为97.28% （RSD=1.42%）；黄芪多糖的线性范围为10～100 ?g，平均回收率为99.02%（RSD=0.94%）。生长1年以上黄芪中黄芪甲苷含量均符合《中华人民共和国药典》标准，生长3年者黄芪甲苷含量最高；生长3年者黄芪多糖含量最高，2年者稍低。结论 从黄芪甲苷和黄芪多糖的含量综合来看，适宜采收的黄芪生长年限至少为2年。
关键词：黄芪；黄芪甲苷；黄芪多糖；含量测定
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.11.024
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）11-0079-04
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membramacens （Fisch.） Bge. var. mongholicus （Bge.） Hsiao或膜荚黄芪A. membramacens （Fisch.） Bge.的干燥根，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生
基金项目：国家中医药管理局中医药科学技术研究专项（国中医药科2006ZX02）
通讯作者：丁家欣，E-mail：dingjiaxin06@126.com
肌等功效[1]。黄芪甲苷和黄芪多糖是黄芪最重要的有效成分，具有广泛的药理作用[2-6]。黄芪在我国分布很广，许多地方均有种植。本试验采用高效液相色谱法（HPLC）测定黄芪甲苷含量，苯酚-硫酸比色法测定黄芪多糖含量，通过比较不同生长年限黄芪中2种成分的含量，为选择适宜的采收时间提供依据。
1 仪器与试药
美国HP1100高效液相色谱仪（G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，HP化学工作站），美国Alltech 2000蒸发光散射检测器，XWK-Ⅲ无油无音空气泵（天津市分析仪器厂）；UV8453型紫外-可见分光光度计（美国安捷伦科技有限公司）；SARTARIUS BT25S电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；电热恒温水浴锅（GSY-Ⅱ型，北京市医疗设备厂）。
不同生长年限黄芪药材采自山西省五寨县，经中国中医科学院中药研究所何希荣老师鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge. var. mongholicus （Bge.） Hsiao的根部，除去须根及根头，洗净，切片，晾干。
黄芪甲苷（批号0781-200109）、无水葡萄糖（批号110833-200503）对照品，均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯（J.T.baker）；甲醇，正丁醇，乙醇、苯酚、硫酸、无水乙醇均为分析纯（北京化学试剂公司）；超纯水由Millipore超纯水系统制备。
2 方法与结果
2.1 黄芪甲苷含量测定
2.1.1 色谱条件 采用Hypersil-Keystone C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（33∶67）；流速1 mL/min；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度105 ℃，空气流速2.7 L/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。黄芪甲苷的保留时间约为14 min。色谱图见图1。
2.1.2 对照品溶液的制备 取干燥至恒重的黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.314 mg的溶液。
2.1.3 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液4、8、10、15、20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量的自然对数为横坐标，对照品峰面积的自然对数为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=1.5475X+4.7489，r=0.9996，线性范围为1.25～6.28 μg，
2.1.4 供试品溶液的制备 取黄芪药材粉末（过4号筛）约4 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流提取4 h，提取液回收甲醇并浓缩至干，残渣加水10 mL微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次20 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取续滤液，即得。
2.1.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液10 μL，在所确定的色谱条件下，连续进样5次，测得黄芪甲苷峰面积RSD=1.33%，表明精密度良好。
2.1.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液（编号WZ-09）10 μL，分别于制备0、2、4、8、12、24 h依次进样，测得黄芪甲苷峰面积RSD=2.42%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.1.7 重复性试验 取黄芪药材（编号WZ-09）粉末5份，每份4 g，精密称定，按“2.1.4”方法处理后，在所确定的色谱条件下进行测定。RSD=2.01%，表明方法的重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知黄芪甲苷含量（0.098%）样品（编号WZ-09）6份，每份2 g，分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液（0.211 3 mg/mL）各1 mL，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液并按上述色谱条件测定，结果见表1。
2.2 黄芪多糖含量测定
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品100 mg，置100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。
2.2.2 苯酚液的配制 取苯酚100 g，加铝片0.1 g 和碳酸氢钠0.05 g，常温蒸馏，收集182 ℃馏分。所得新馏苯酚用水配成5%苯酚水溶液（棕色瓶保存）。
2.2.3 最大吸收波长的选择 精密吸取葡萄糖对照品溶液60 μL，置于10 mL具塞试管中，加水定容至2 mL，另取2.0 mL蒸馏水作空白对照，精密加入1 mL苯酚液，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，静置5 min，置沸水浴中反应15 min后取出并放至室温，于紫外分光光度计波长400～600 nm范围内扫描，测得最大吸收波长为490 nm。
2.2.4 线性关系考察 精密吸取葡萄糖对照品溶液10 mL，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取稀释后的葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，加蒸馏水使体积为2.0 mL，另取2.0 mL蒸馏水作空白对照。按“2.2.3”项下方法操作，于490 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A=0.705 1C+0.002 2，r=0.999 4，葡萄糖在10～100 ?g范围内呈良好线性关系。
2.2.5 供试品溶液的制备 取黄芪药材30 g，加12倍量水，煮煎3次，每次1.5 h，合并3次水煎液，浓缩至24 mL（即1∶0.8），加入95%乙醇，使含醇量为70%，静置12 h以上，4000 r/min离心10 min，滤出沉淀，用无水乙醇洗涤2次，加水溶解，定容至30 mL，加入95%乙醇，使含醇量为80%，静置后离心，滤出沉淀，用无水乙醇洗涤多次，水浴蒸至无醇味，加水搅拌使充分溶解，离心，取上清液置于100 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，作为供试品溶液。
2.2.6 重复性试验 平行称取黄芪药材（编号WZ-09） 30 g，共6份。按“2.2.5”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下方法操作，测定吸光度，计算多糖含量，结果RSD=1.42%，表明方法重复性良好。
2.2.7 稳定性试验 取同一样品（编号WZ-09）溶液，分别在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h测定吸光度，计算RSD=0.50%，表明样品溶液在3 h内基本稳定。
2.2.8 加样回收率试验 精密量取已知含量（3.45%）的“2.2.5”项下供试品溶液（编号WZ-09）1.0 mL，共6份，每份精密加入葡萄糖对照品溶液（1 mg/mL）1 mL，定容至10 mL量瓶中，按“2.2.3”项下方法操作，测定吸光度，计算回收率，结果见表2。
2.3 样品含量测定
采用建立的样品处理方法和测定方法测定23批黄芪中黄芪甲苷和黄芪多糖的含量。结果生长年限1年者黄芪甲苷的含量范围在0.048%～0.096%之间，2年者在0.092%～0.128%之间，3年者在0.111%～0.205%之间，4年者在0.110%～0.195%之间，5年者在0.096%～0.198%之间。生长年限1年者黄芪多糖含量范围在1.87%～2.45%之间，2年者在2.22%～3.61%之间，3年者在2.68%～4.24%之间，4年者在2.01%～3.44%之间，5年者在2.24%～3.94%之间。结果见表3。
2.2 黄芪多糖含量测定
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品100 mg，置100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。
2.2.2 苯酚液的配制 取苯酚100 g，加铝片0.1 g 和碳酸氢钠0.05 g，常温蒸馏，收集182 ℃馏分。所得新馏苯酚用水配成5%苯酚水溶液（棕色瓶保存）。
2.2.3 最大吸收波长的选择 精密吸取葡萄糖对照品溶液60 μL，置于10 mL具塞试管中，加水定容至2 mL，另取2.0 mL蒸馏水作空白对照，精密加入1 mL苯酚液，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，静置5 min，置沸水浴中反应15 min后取出并放至室温，于紫外分光光度计波长400～600 nm范围内扫描，测得最大吸收波长为490 nm。
2.2.4 线性关系考察 精密吸取葡萄糖对照品溶液10 mL，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取稀释后的葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，加蒸馏水使体积为2.0 mL，另取2.0 mL蒸馏水作空白对照。按“2.2.3”项下方法操作，于490 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A=0.705 1C+0.002 2，r=0.999 4，葡萄糖在10～100 ?g范围内呈良好线性关系。
2.2.5 供试品溶液的制备 取黄芪药材30 g，加12倍量水，煮煎3次，每次1.5 h，合并3次水煎液，浓缩至24 mL（即1∶0.8），加入95%乙醇，使含醇量为70%，静置12 h以上，4000 r/min离心10 min，滤出沉淀，用无水乙醇洗涤2次，加水溶解，定容至30 mL，加入95%乙醇，使含醇量为80%，静置后离心，滤出沉淀，用无水乙醇洗涤多次，水浴蒸至无醇味，加水搅拌使充分溶解，离心，取上清液置于100 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，作为供试品溶液。
2.2.6 重复性试验 平行称取黄芪药材（编号WZ-09） 30 g，共6份。按“2.2.5”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下方法操作，测定吸光度，计算多糖含量，结果RSD=1.42%，表明方法重复性良好。
2.2.7 稳定性试验 取同一样品（编号WZ-09）溶液，分别在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h测定吸光度，计算RSD=0.50%，表明样品溶液在3 h内基本稳定。
2.2.8 加样回收率试验 精密量取已知含量（3.45%）的“2.2.5”项下供试品溶液（编号WZ-09）1.0 mL，共6份，每份精密加入葡萄糖对照品溶液（1 mg/mL）1 mL，定容至10 mL量瓶中，按“2.2.3”项下方法操作，测定吸光度，计算回收率，结果见表2。
2.3 样品含量测定
采用建立的样品处理方法和测定方法测定23批黄芪中黄芪甲苷和黄芪多糖的含量。结果生长年限1年者黄芪甲苷的含量范围在0.048%～0.096%之间，2年者在0.092%～0.128%之间，3年者在0.111%～0.205%之间，4年者在0.110%～0.195%之间，5年者在0.096%～0.198%之间。生长年限1年者黄芪多糖含量范围在1.87%～2.45%之间，2年者在2.22%～3.61%之间，3年者在2.68%～4.24%之间，4年者在2.01%～3.44%之间，5年者在2.24%～3.94%之间。结果见表3。
2.2 黄芪多糖含量测定
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品100 mg，置100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。
2.2.2 苯酚液的配制 取苯酚100 g，加铝片0.1 g 和碳酸氢钠0.05 g，常温蒸馏，收集182 ℃馏分。所得新馏苯酚用水配成5%苯酚水溶液（棕色瓶保存）。
2.2.3 最大吸收波长的选择 精密吸取葡萄糖对照品溶液60 μL，置于10 mL具塞试管中，加水定容至2 mL，另取2.0 mL蒸馏水作空白对照，精密加入1 mL苯酚液，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，静置5 min，置沸水浴中反应15 min后取出并放至室温，于紫外分光光度计波长400～600 nm范围内扫描，测得最大吸收波长为490 nm。
2.2.4 线性关系考察 精密吸取葡萄糖对照品溶液10 mL，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取稀释后的葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，加蒸馏水使体积为2.0 mL，另取2.0 mL蒸馏水作空白对照。按“2.2.3”项下方法操作，于490 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A=0.705 1C+0.002 2，r=0.999 4，葡萄糖在10～100 ?g范围内呈良好线性关系。
2.2.5 供试品溶液的制备 取黄芪药材30 g，加12倍量水，煮煎3次，每次1.5 h，合并3次水煎液，浓缩至24 mL（即1∶0.8），加入95%乙醇，使含醇量为70%，静置12 h以上，4000 r/min离心10 min，滤出沉淀，用无水乙醇洗涤2次，加水溶解，定容至30 mL，加入95%乙醇，使含醇量为80%，静置后离心，滤出沉淀，用无水乙醇洗涤多次，水浴蒸至无醇味，加水搅拌使充分溶解，离心，取上清液置于100 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，作为供试品溶液。
2.2.6 重复性试验 平行称取黄芪药材（编号WZ-09） 30 g，共6份。按“2.2.5”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下方法操作，测定吸光度，计算多糖含量，结果RSD=1.42%，表明方法重复性良好。
2.2.7 稳定性试验 取同一样品（编号WZ-09）溶液，分别在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h测定吸光度，计算RSD=0.50%，表明样品溶液在3 h内基本稳定。
2.2.8 加样回收率试验 精密量取已知含量（3.45%）的“2.2.5”项下供试品溶液（编号WZ-09）1.0 mL，共6份，每份精密加入葡萄糖对照品溶液（1 mg/mL）1 mL，定容至10 mL量瓶中，按“2.2.3”项下方法操作，测定吸光度，计算回收率，结果见表2。
2.3 样品含量测定
采用建立的样品处理方法和测定方法测定23批黄芪中黄芪甲苷和黄芪多糖的含量。结果生长年限1年者黄芪甲苷的含量范围在0.048%～0.096%之间，2年者在0.092%～0.128%之间，3年者在0.111%～0.205%之间，4年者在0.110%～0.195%之间，5年者在0.096%～0.198%之间。生长年限1年者黄芪多糖含量范围在1.87%～2.45%之间，2年者在2.22%～3.61%之间，3年者在2.68%～4.24%之间，4年者在2.01%～3.44%之间，5年者在2.24%～3.94%之间。结果见表3。
