一测多评法与外标法测定胆黄连中生物碱类成分含量比较

一测多评法与外标法测定胆黄连中生物碱类成分含量比较

王静+陈悦+袁子民

摘要：目的 建立一测多评法（QAMS）测定胆黄连中3种生物碱成分含量，并与外标法测定结果进行比较，探讨QAMS的可行性。方法 采用高效液相色谱法，以盐酸小檗碱为内参物，建立盐酸小檗碱与盐酸巴马汀、盐酸药根碱间的相对校正因子，用所得相对校正因子进行含量计算（计算值），实现一测多评。同时采用外标法测定3个成分的含量（实测值），比较计算值与实测值的差异。结果 10批胆黄连中3种生物碱成分含量的计算值与实测值无显著差异。结论 QAMS可用于胆黄连中生物碱类成分的含量测定。

关键词：一测多评法；外标法；胆黄连；生物碱；相对校正因子

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.019

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）11-0078-03

Abstract： Objective To establish QAMS method to determine the contents of three alkaloids in bile processed Coptidis Rhizoma； To compare the results of QAMS with those from external standard method； To prove the feasibility of QAMS. Methods An HPLC method was developed. Berberine hydrochloride was selected as the internal reference substance. 2 relative correction factors （RCF） of berberine hydrochloride to palmatine hydrochloride and to jatrorrhizine hydrochloride were established. Obtained RCFs were used to conduct content calculation （calculated value） to complete QAMS method. At the same time， the contents （measured value） of the three components were also determined by external standard method. Calculated value and measured value were compared. Results The analysis results showed that there was no significant difference between the calculated values and the measured values of the three alkaloids in 10 batches of bile processed Coptidis Rhizoma. Conclusion The QAMS method can be applied in the determination of alkaloids in bile processed Coptidis Rhizoma.

Key words： QAMS； external standard method； bile processed Coptidis Rhizoma； alkaloids； relative correction factors

胆黄连是黄连的炮制品之一，以猪胆汁炮制后，黄连的寒性增强，是“寒者益寒”“从制”的经典实例[1]。本试验在前期确定胆黄连炮制工艺、药效作用的基础上，采用一测多评法（QAMS）对胆黄连中盐酸药根碱、盐酸巴马汀与盐酸小檗碱含量进行研究，并将外标法和QAMS测定结果进行比较，建立胆黄连中3种生物碱类成分QAMS的含量测定方法，为胆黄连的质量评价和炮制机理研究提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱仪（chemistation system工作站），SG3300型超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司），赛多利斯BT25S分析天平。

黄连购自大连权健中药饮片有限公司（批号20130612，产地四川），经辽宁中医药大学鉴定教研室李峰教授鉴定为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎；猪胆汁购于大连猪肉市场；胆黄连饮片自制10批（黄连饮片，加6%猪胆汁水溶液拌匀，闷润1 h，94 ℃翻炒19 min制得[2]）；盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212）、盐酸药根碱对照品（批号110733-201108）、盐酸巴马汀对照品（批号110732-201108），中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其他试验均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别取盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇-盐酸（100∶1）溶液，配制成浓度为0.042、0.046、0.131 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取胆黄连粉末（过二号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100∶1）溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用甲醇-盐酸（100∶1）溶液补足减失的质量，摇匀，过滤。精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 ?m滤膜，取续滤液，即得[3]。

2.3 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相A为乙腈，B为磷酸三乙胺水溶液（精密量取磷酸3 mL，三乙胺2 mL，置1000 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得），梯度洗脱（0～15 min，25%～30%A；15～20 min，30%～55%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：345 nm；柱温为室温；进样量：10 ?L[4]。理论塔板数按盐酸小檗碱计算应不低于3000。色谱图见图1。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 ?L，依次注入液相色谱仪，记录各色谱峰，以进样量对峰面积进行线性回归，结果表明，各成分在相应的范围内与峰面积呈良好的线性关系，见表1。

2.5 精密度试验

取同一胆黄连饮片供试品（批号20140301）溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次，每次10 ?L，记录峰面积，结果盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为1.85 %、1.65 %、1.18 %，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一胆黄连饮片（批号20140301），按“2.2”项下方法分别制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样，测定含量，结果盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱平均含量分别为15.31、16.76、56.44 mg/g，RSD分别为1.25%、1.02%，0.55%，表明本法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一份胆黄连供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h，精密吸取10 ?L，在上述色谱条件下测定峰面积，计算RSD，结果盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为1.71%、1.25%、1.13%，表明8 h内供试品溶液稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的胆黄连（批号20140301，盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量分别为15.19、16.79、56.37 mg/g）约0.1 g，平行6份，分别按样品含量加入盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定含量，结果盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的平均回收率分别为100.1%、100.1%、99.9%，RSD分别为1.60%、1.34%、1.33%。

2.9 一测多评法的建立

2.9.1 校正因子的计算 以盐酸小檗碱为内参物，按公式fk/m=fk/fm=Wk/Wm×（Am/Ak）计算盐酸药根碱、盐酸巴马汀的校正因子，式中Ak和Wk分别为内参物的峰面积和浓度，Am和Wm分别为其他组分m的峰面积和浓度[5-7]。盐酸药根碱、盐酸巴马汀和内参物盐酸小檗碱间的校正因子分别为0.083 3、0.399 5。

2.9.2 一测多评法与外标法测定结果的比较 取10批胆黄连，按“2.2”项下方法制备胆黄连供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液10 ?L，注入高效液相色谱仪，记录峰面积。分别采用外标法和QAMS计算胆黄连中盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量，结果见表2。测定结果表明，2种方法测得的各成分含量间无显著差异，说明采用QAMS测定结果准确可靠。

3 讨论

本研究对不同条件下（色谱仪、色谱柱、流速、柱温）测定的相对校正因子的重复性进行了考察，结果表明相对校正因子均无明显变化。另外，采用相对保留值法和保留时间差法对待测组分的色谱峰进行了定位，结果表明，2种方法均能准确定位色谱峰，但相对保留值法应用更为广泛，且RSD更小，因此采用相对保留值法定位色谱峰。

本研究采用外标法和QAMS测定了10批自制胆黄连饮片的3种生物碱含量，结果表明2种方法测得的含量无明显差异，说明该QAMS准确可靠，可以同时测定胆黄连中盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀的含量。

参考文献：

[1] 龚千锋.中药炮制学[M].北京：中国中医药出版社，2007：160.

[2] 王静，陈悦，袁子民，等.响应面法优化胆黄连的炮制工艺[J].中华中医药学刊，2015，33（6）：1298-1230.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：303-304.

[4] 王静，张朔，杨艳云，等.高效液相色谱法同时测定左金丸提取物中五种成分的含量[J].辽宁中医杂志，2009，36（5）：804-805.

[5] 赵君颖，汪坤，张振凌.一测多评法比较不同黄连炮制品中4种生物碱的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（18）：11-13.

[6] 刘晖晖，张辉，莫结丽，等.一测多评法测定黄连配方颗粒中4个成分的含量[J].中国药业，2012，21（10）：39-40.

[7] 匡艳辉，朱晶晶，王智民，等.一测多评法测定黄连中小檗碱、巴马汀、黄连碱、表盐酸小檗碱、药根碱含量[J].中国药学杂志，2009，44（5）：390-394.